AG电投厅(Asia Gaming)

近日，华中农业大学动科院赵书红、徐学文老师团队在Genomics（JCR二区，影响因子5.73）发表了题为“Epigenomics analysis of miRNA cis-regulatory elements in pig muscle and fat tissues”的研究论文。该文分析并整合了已发表大白猪肌肉和脂肪组织的表观多组学数据，识别了miRNA的功能顺式调控元件，为理解猪肌肉和脂肪中miRNA调节的分子机制提供了理论依据。AG电投厅(Asia Gaming)基因为本项目表观多组学分析工作提供了资源支持。

miRNA通过调控下游靶基因在猪骨骼肌和脂肪组织的生长发育、能量代谢过程中发挥着至关重要的作用；与此同时，miRNA的表达也受到上游启动子、增强子的调控。尽管伴随着 DNA 元件百科全书(ENCODE)计划的不断完善，猪蛋白编码基因及长链非编码基因的顺式调控元件被大规模鉴定，然而关于猪miRNA的顺式调控元件鉴定工作，鲜有报道。基于此，本文整合分析了两周龄大白猪的骨骼肌和脂肪组织miRNAome数据与已发表的ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq及 Hi-C数据，系统的注释了猪骨骼肌组织和脂肪组织中的miRNA顺式调控元件。

材料：2周龄大白猪的两个背最长肌和两个背部皮下脂肪组织

测序：Small RNA

分析：miRNA+表观多组学已发表数据（ChIP-seq+ATAC-seq+RNA-seq+ Hi-C）联合分析

3.1 Small RNA测序分析

通过对2周龄大白猪的两个背最长肌和两个背部皮下脂肪组织样本进行small RNA测序分析，共鉴定出419个miRNA，包括359个已知的和60个新的miRNA（图1b）。皮尔逊相关系数（PCCs）分析表明数据的可靠性（图1c）。

图1. 长白猪猪肌肉和脂肪组织中miRNA的鉴定

3.2 猪肌肉和脂肪组织中miRNA顺式调控元件的鉴定

通过对H3K4me3，H3K27ac组蛋白ChIP-seq及ATAC-seq分析显示，这些表观遗传修饰信号明显富集在大多数pre-miRNA周围，且信号高度一致（图2a，b）。深入分析发现在肌肉和脂肪中表达的pre-miRNA中， 分别有84.21%和85.51%可能与一个启动子有关，其中69.64%和72.46%的启动子被鉴定为阳性启动子，其余的称为候选启动子（图2c）。此外，超过70%和75%的启动子与CpG岛重叠，并被鉴定为活性启动子，表明miRNA启动子鉴定的准确性（图2d）。作者进一步鉴定增强子，结果显示，肌肉和脂肪中分别有65.18%和65.25%的启动子相关pre-miRNA至少与一种增强子相关（图2e），这些pre-miRNA中分别有76.03%和78.57%受多种增强子的调节（图2f）。

图2. miRNA顺式调节元件的鉴定

3.3 猪基因组中miRNA顺式调控元件的分析

为了研究miRNA转录调控与基因组3D结构之间的关系，作者首先利用Hi-C数据区分了位于Compartment A和 B的miRNA，结果显示，Compartment A中的miRNA表达水平显著高于B中（图3a，b）；其次分析H3K27ac ChIP-seq数据与miRNA关系，发现带有活性启动子的miRNA数量显著高于没有活性启动子的miRNA（图3c，d）。同时，超级增强子相关miRNA的表达显著高于普通增强子相关miRNA的表达（图3e，f）。作者随后比较猪和人类基因组之间的miRNA顺式调控元件，结果显示，超过90%的miRNA启动子和约85%的miRNA增强子与人类基因组序列保持一致（图3g）；大约55%启动子和21%的miRNA增强子在序列和作用上都是保守的（图3g）。

图3. miRNA顺式调控元件的调控分析和验证

3.4 猪基因组中miRNA顺式调控元件的验证

为了验证得到的miRNA顺式调控元件真实性，作者采用了双荧光报告系统和CRISPR/Cas9技术验证了miRNA增强子和启动子的活性及调控功能（图4）。

图4. 双荧光素酶报告系统分析miRNA顺式调节元件及miRNA增强子敲除

3.5 肌肉和脂肪组织中核心miRNA的鉴定和功能分析

为了确定可能在脂肪和肌肉组织中起关键作用的miRNA，分别在肌肉（红线）和脂肪（蓝线）中挑选除表达排名变化最大的前5%个miRNA，被选为为核心miRNA（图5a，b）。将这些核心miRNA与所有差异表达miRNA相比，结果显示大多数核心miRNA变化倍数高（图5b）。使用Targetscan和miRDB预测27个已知的miRNA，用IntaRNA和DIANA预测8个新发现的miRNA，选择两个程序的重叠结果作为最终目标基因（图5c，d）。对这些核心miRNA进行靶基因预测，GO富集分析表明，除了DNA转录、细胞迁移、蛋白质磷酸化和细胞周期等常见的生物学过程外，肌肉中核心miRNA的靶基因参与了与成肌细胞命运承诺、脂质代谢过程、pri-miRNA转录负调控和能量代谢过程（图5g），脂肪核心miRNA的靶基因主要在与糖酵解和类固醇激素代谢过程中富集（图5g）。

图5. 猪肌肉和脂肪中核心miRNA的选择和靶基因预测

3.6 核心miRNA顺式调控元件中组蛋白修饰和转录因子结合

在核心miRNA顺式调控元件研究中，作者发现H3K27ac信号的变化与肌肉和脂肪组织之间miRNA表达水平的差异一致（图6a）。在肌肉和脂肪组织差异表达的miRNA中上调的miRNA顺式调控元件（启动子和增强子）的H3K27ac信号的变化倍数显著高于无差异性miRNA和下调的差异表达miRNA（图6b）。同时发现，肌肉和脂肪之间的差异表达miRNA顺式调节元件中转录因子结合数量的变化与H3K27ac信号的变化一致（图6c）。这些结果表明，H3K27ac修饰和miRNA顺式调控元件的转录因子协同调控核心miRNA的表达。进一步分析发现肌肉核心miRNA的顺式调控元件中检测出19个显著富集的转录因子，脂肪组织中则检测到21个显著富集的转录因子（图6）。

图6. 组蛋白修饰的变化与核心miRNA顺式调控元件的下游分析

本文利用miRNA、ChIP-seq、ATAC-seq、RNA-seq和Hi-C等多种组学研究技术，确定并描述了猪肌肉和脂肪组织中的miRNA及其顺式调控元件。发现超级增强子、活性启动子和Compartment A相关的miRNA数量分别显著高于与普通增强子、启动子缺少的H3K27ac和Compartment B区相关的miRNA，随后在细胞水平验证了上述顺式调控元件的准确性。此外，作者确定了肌肉和脂肪中与相应组织功能相关的核心miRNA，表明组织特异性转录因子是肌肉和脂肪中核心miRNA表达模式的主要决定因素。该研究为现有的猪表观遗传学数据增添了重要信息，为今后深入研究猪表观遗传学提供了必要的资源。

华中农业大学动科动医学院博士研究生胡明阳、硕士研究生匡仁卓和博士研究生郭亚苹为论文共同第一作者，华中农业大学动科动医学院赵云霞副研究员和徐学文教授为论文共同通讯作者。该研究得到国家自然基金、湖北省自然科学基金、岭南现代农业项目实验室和国家重点研发计划等项目资助。